Színészi karrierje 11 hónapos korában kezdődött, amikor egy játék reklámfilmjében jelent meg. Később megkapta Sarah Roberts szerepét az ABC One Life To Live című szappanoperájában. Nyolcévesen már Lizzie Spauldingként szerepelt a CBS Guiding Light című sorozatában. Ezt a karaktert 2001-ig alakította. A Guiding Lightban Hayden karaktere leukémiában szenved. A leukémia ilyen jellegű megjelenítéséért a sorozatot a Leukemia and Lymphoma Society egy különdíjjal ismerte el. Panettiere több mint egy tucat mozifilmben tűnt fel és számos TV-filmben is szerepelt. Főszerepe volt a FOX Ally McBeal című sorozatában, visszatérő vendégszereplő volt a Malcolm in The Middle című sorozatban, és egy epizód erejéig a Különleges ügyosztályban is.

Panettiere-t 1999-ben Grammy-díjra jelölték az Egy bogár élete című film alapján készült hangos könyvért. Ezen felül ő volt Kairi hangja a PlayStation 2-re kiadott, sikeres Kingdom Hearts játéksorozatban.

A Neutrogena kozmetikai cég címlaplányának választotta a világméretű kampányához, így olyan korábbi színésznőket követ, mint például Jennifer Love Hewitt, Mandy Moore, Kristin Kreuk vagy Mischa Barton.

Panettiere jelenleg az NBC Hősök című sorozatának egyik főszereplője, Claire Bennet karakterének alakítója, egy olyan gimnazista lányé, aki felfedezi, hogy sérülései azonnal regenerálódnak.