Jensen Ackles 1978. március 1-jén Dallas-ban (Texas, USA) született a színész Roger Alan Ackles és Donna Joan Shaffer második gyermekeként. Angol, ír és skót felmenőkkel is büszkélkedhet. Két testvére van: egy bátyja Joshua, és egy húga, Mackenzie. A szülei azért nevezték Jensen-nek, mert nem akartak túl gyakori nevet adni neki.

Jensen édesapja ismert színész volt a városban, ezért Jensen gyermekkorának is része volt a színészkedés, annak ellenére, hogy a gimnáziumig nem is igazán akart színészi pályára lépni. Négyévesen kezdett modellkedni, majd később abbahagyta, de 10 évesen újrakezdte.

Az L. V. Berkner High School-ba jelentkezett, ahol sportorvosnak tanult. Ekkor felkereste két férfi: Jensen későbbi menedzsere, Craig Wargo, és egy másik ügynök, Michael Einfeld. Arra kérték, hogy menjen Los Angeles-be velük, de Jensen előbb be akarta fejezni a gimnáziumot, mert azt hitte, hogy ezt a két fickót hamarosan nem is fogja érdekelni. Nem ez történt. A két férfi tartotta vele a kapcsolatot, egészen addig amíg leérettségizett, majd LA-be vitték. Első jelentősebb szerepe Malcolm megformálása volt a Mr. Rhodes című sorozatban. Ezt követően az USA egyik leghosszabb szappanoperájában, az Ármány és szenvedélyben szerepelt három éven át. Majd következett a nagy sikerű Sötét Angyal - Dark Angel, melyben Alec karakterét keltette életre.

2000-ben pályázott Clark Kent szerepére a Smallville-ben, ám akkor az ifjú modell, Tom Welling elhalászta előle a szerepet. Így egy másik WB-sikersorozattal, a Dawson és a haverokkal vígasztalódott, ahol a hatodik évadban, 12 epizód erejéig játszotta C.J.-t.

Ezek után csatlakozhatott a Smallville-hez. Igaz, nem Clark Kent-ként, hanem Jason Teague megformálójaként. Ezt a szerepet egy évadon keresztül játszotta. Majd jött karrierje eddigi legnagyobb sikere, az Odaát, ahol Jared Padalecki társaként démonokra, szellemekre és egyéb természetfeletti lényekre vadászik.